真菌培养及鉴定方法有哪些

　　真菌的营养要求不向。在一般细菌培养基上均能生长。真菌培养及鉴定有哪些的呢?本文是小编整理真菌培养及鉴定的资料，仅供参考。

　　真菌培养及鉴定

　　1.采集标本 体表真菌的标本有毛发、皮屑、甲屑、痂等，标本在分离前常先用75%的乙醇消毒。深部真菌的标本可根据情况取痰、尿液、粪便、脓液、口腔或阴-道分泌物、血液、脑脊液、各种穿刺液和活检组织，采集标本应注意无菌操作。

　　2.培养检查：可提高真菌检出率，并能确定菌种。标本接种于葡萄糖蛋白胨琼脂培养基(Sabouraud agar)上，置室温或37℃培养1～3周。必要时可行小培养协助鉴定。菌种鉴定常根据菌落的形态及显微镜下形态判断。对某些真菌，有时尚需配合其他鉴别培养基、生化反应、分子生物学方法确定。

　　真菌培养的方法与直接镜检法相比较而言，更能对大部分真菌感染的灰指甲作出准确的鉴定，也是诊断灰指甲的一个很重要的手段。下面我们就从培养基的选择、培养时间、菌种鉴定三方面来了解一下灰指甲的真菌培养法。

　　1.培养基的选择

　　通常培养真菌会同时选用两种培养基，如果单用一种培养基，则容易忽略其它种类的真菌诊断。常见的两种培养基，一种为沙氏葡萄糖琼脂培养基中加抗菌剂，常为氯霉素和放线菌酮;另一种是沙氏葡萄糖琼脂培养基中仅加氯霉素，不加放线菌酮。

　　2.培养时间

　　各种真菌的生长速度不同，所以报告的时间也不同。一般皮肤癣菌生长较缓慢，在26℃-28℃的环境下需要培养2-4周才能发报告，但是，皮肤癣菌含盖的菌种较多也需要区别对待;酵母菌生长较快，通常2-3就可以发报告，如果为阴性则需要观察1周;霉菌生长也比较快，一般2-4天就可以发报告。

　　3.菌种鉴定

　　(1)丝状真菌：包括皮肤癣菌和霉菌，根据菌落形成所需要的时间，在不同条件下生长的情况，菌落表面及背面的形态、色素，培养基中有无色素，培养物用乳酚棉蓝染色后镜检找特征性标志结构。(2)酵母菌：分为形态学鉴定及生化试验。形态学鉴定主要观察有无假菌丝产生，如有则为念珠菌属，如无则为念珠菌以外的酵母菌;生化试验最为常用的是API系统，用此法鉴定准确，但价格较贵。

　　)丝状真菌：主要是形态学的鉴定，如直接涂片观察，小培养显微镜鉴定，诱导形态观察(25℃与35℃下双相型真菌的特征孢子及菌丝的产生和两种菌落的形成及脑心浸液琼脂培养基，KT培养基，KelleyAgar培养基转相诱导，另外常用的还有皮肤癣菌VB1生长刺激，吴氏荧光检查，毛发穿孔试验及在特殊情况下进行的一些生化鉴定等。其中，小培养显微镜检对于丝状真菌的鉴定，特点是动态直观，易于观察，且节约材料。解放军总医院第一附属医院皮肤科马天

　　(2)酵母菌鉴定：形态学鉴定主要是玉米吐温诱导下特征菌丝及特征孢子的检验，血清芽管形成，而在形态学基础上还必须进行生化鉴定：有标准鉴定，自动仪器鉴定，显色鉴定，其中，自动仪器鉴定(如API20C，ID32C等)，显色鉴定对于酵母样真菌的鉴定，特点是快速简便;标准鉴定是按传统双歧表流程鉴定(包括糖同化试验，糖发酵试验，CAFC酚氧化酶试验，尿酶试验，KNO3同化试验，脂肪酸需求试验)，是真菌鉴定的金标准，系统准确，缺点是程序繁琐，耗时长，与临床治疗不太适应。此外，还有血清学玻片凝集试验，动物致病性实验，分子生物学鉴定：如核酸杂交，DNA探针杂交，PCR扩增序列分析，PCR-SSCP单链构象多态性分析，PCR-RFLP限制性片段长度多态性分析，PCR-RAPD随机扩增多态性分析，PFCG脉冲电泳核型分析等。

　　对于酵母样真菌首选CHROMagar念珠菌显色培养基，而显色培养基不能鉴定的酵母样真菌可采用自动仪器YBC卡进行鉴定或API板;条件较差的实验室可采用传统标准鉴定法中鉴定值较高的试验，如酚氧化酶鉴定新型隐球菌(+)，尿素区分毛孢子菌属(+)，地丝菌属(-)，念珠菌属(-)(克柔念珠菌/溶脂念珠菌+)，球拟酵母属(-)，隐球菌属(+)，玉米-土温培养基上产菌丝区分念珠菌属(+)与球拟酵母属(-)，隐球菌属(-)与毛孢子菌属(+)，地丝菌属(+)。而同化试验推荐平皿法，一个平皿内可观察多种糖类的同化情况，且结果易于观察，重复性好。对于丝状真菌及双相型真菌，可采用小培养法，快速简便易于观察。而对于双相型真菌还须经过脑心浸液培养基转相试验后确证。而血清学及分子生物学则主要用于流行病学和一些难培养难鉴定真菌的检验，由于成本高或要求技术难度较高，故而不适合在常规工作中采

　　真菌的培养特性

　　真菌的营养要求不向。在一般细菌培养基上均能生长。检查时常用沙保培养基。此培养基成分简单，主要含有1%蛋白陈、4%葡萄糖和2%琼脂，pH佰55.皮肤癣拘在此培养基上生长较慢，常需1～4周;世腐生性真构在此培养基上生长迅速。故分离真菌时常在此培养基户加一定量的放线菌酮和氯霉素，前者用于抑制污染真菌，后者用于抑制细惭的生长。有些病原性真菌，如白假丝酵球菌、组织脑浆茵、新生隐球菌竿加放线菌酮即不能生良，故宜用力抗生京的血琼脂平板，见有生长后移种沙保培养基，并问时做玻片培养以观察其自然状态下的形态结构。 培养真菌最适宜的酸碱度是PH值4.0～6.0，浅部感染真菌的最道温度为22～28℃，但某些诛部感染真菌一般在37℃牛长最好。培养真菌需较尚的湿度与氧。

　　真菌的培养方法

　　玻片培养又称小培养，小培养法可以随时观察真菌的生长形态(如大分生孢子、小分生孢子及孢子柄等)，还可以随时观察其生长发育的全部情况，有利于菌种的鉴定。

　　1、钢环法

　　(1)材料：白假丝酵母菌、沙保弱培养基、无菌玻片、盖玻片、钢环(带有缺 口)、石蜡。

　　(2)方法

　　①用无菌镊子取无菌小培养钢环，环的两面分别蘸取熔化的固体石蜡，平置于无菌载玻片上，另取一无菌盖玻片，在酒精灯火焰上加热后覆盖于钢环上，待冷后，小培养钢圈即被固定于载玻片与盖玻片之间。

　　②用毛细滴管吸取融化的培养基，从钢环上端孔注入，注入量占容积的1/2即可。

　　③培养基冷却凝固后，用接种针挑取材料，由上端孔接种于环内培养基上。

　　④置湿盒内，室温或37℃下培养2—3d后，逐日观察，镜下可连续看到真菌生长过程及菌丝、孢子等特征，一般7d左右即可长好。

　　⑤也可不用小培养钢环，直接将融化的培养基滴于无菌玻片上，待冷凝后从周边接种材料，用盖玻片覆盖后培养，在显微镜下连续观察生长情况。

　　(3)结果：镜下观察可见到有胞壁增厚的厚膜孢子及假菌丝。

　　2、小块琼脂玻片培养法

　　用无菌操作法将制好的待用琼脂平板用无菌接种针或接种环切成大约1cm2的方块，将其放置于灭菌的载玻片上。将标本或待检菌接种于琼脂块四周边缘靠上方部位，然后用无菌镊子取一无菌的盖玻片盖在琼脂上。在无菌平皿内放入少量无菌水和一个无菌U形(或V形)玻璃棒。将此载玻片置于玻璃棒上，盖上平皿盖培养。每日用肉眼和显微镜观察孢子和菌丝的特点。

　　拓展内容

　　生物学真菌的形态特征

　　与细菌相比，真菌的大小、形态、结构和化学组成均有很大的差异。真菌比细菌大几倍至几十倍，可以用普通光学显微镜观察。真菌的细胞是典型的真核细胞，真菌细胞具有细胞壁、细胞膜、细胞核、细胞器及细胞质。真菌细胞壁主要化学成分为几丁质(chitin)和1，3-葡聚糖，而细菌细胞壁主要化学成分为肽聚糖。真菌按形态可分为单细胞和多细胞两类。单细胞真菌主要为酵母菌(yeast)和酵母样菌(veast-1ike)，菌体呈圆形或卵圆形，其形成的菌落为酵母型或类酵母型，临床常见的有念珠菌属和新生隐球菌。多细胞真菌由菌丝和孢子组成，菌丝伸长分支，交织成团形成菌丝体(mycelium)，并长有各种孢子，这类真菌称为丝状菌(filamentousfungus)，俗称霉菌(mold)。其形成的菌落为丝状型。对人致病的有皮肤癣菌等。有些真菌可因营养、温度、氧气等环境条件的改变，而两种形态发生互变，称为二相性(dimorphic)。真菌的菌落形态、颜色变化及真菌不同生长时期的镜下特征是正确鉴定真菌的重要依据。

　　(一)真嚣的镜下形态

　　多细胞真菌的菌丝和孢子随真菌种类不同而形态不同，是鉴别真菌的重要依据。

　　1.菌丝是由孢子出芽形成的。孢子在环境适宜的条件下长出芽管，逐渐延长呈丝状即菌丝(hyphae)。当菌丝不断生长、分支并交织成团时，被称为菌丝体(mycelium)。孽警粤结构不同可分为有隔菌丝和无隔菌丝。有隔菌丝(septatehyphae)是由横隔将管状尊构的菌丝分隔成一连串多样的丝状体，如曲霉、青霉和毛癣菌等大多数丝状真菌的菌丝属于此类：无隔菌丝

　　无隔膜，整条菌丝为单个细胞，细胞质内有多个细胞核，根霉和毛霉的菌丝属于此类。菌丝在人工培养基中生长，按其着生情况可分为营乔丽丝(vegetativehyphae)和气生菌丝(aerialhyphae)。菌丝向下生长，深入培养基内获取营养的菌丝称为营养菌丝：而从培养基表面长出向空中伸展的菌丝称为气生菌丝。部分气生菌丝发育到一定阶段可衍化为具有繁殖能力的繁殖菌丝(reproductivehyphae)。菌缝可有多种形态，如螺旋状、球拍状、结节状、鹿角状、梳状和关节状等，它们有助于真菌的鉴别。

　　2.孢子是的繁殖结构，分为有性孢子和无性孢子两类。有性孢子是由同一里体璧不同菌体上的两个细胞融台经减数分裂形成。无性孢子由菌丝上的细菌直接分化或出芽形成，是病原性真菌传播和延续后代的主要方式。真菌孢子抵抗力不强，加热60～70℃短时间即死亡。真菌孢子与细菌芽胞不同，其区别见表22-1。

　　(1)无性孢子：无性孢子根据形态分为分生孢子、叶状孢子和孢子囊孢子三种。

　　①分生孢子：分生孢子是真菌中最常见的一种无性孢子。它首先在繁殖菌丝的末端分化形成分生孢子梗，然后在梗上产生分生孢子。按其形态和结构可分为大分生孢子和小分生孢子。大分生孢子(macroconidium)体积较大，分隔成较多细胞，常呈梭形、棍棒型或梨形。其大小、细胞数和颜色是鉴定真菌的重要依据。小分生孢子体积较小，单细胞性，外壁薄，有球形、卵形、梨形以及棍棒状等各种不同形态。真菌都能产生小分生孢子，其诊断意义不大。

　　②叶状孢子(thallospore)：叶状孢子是由菌丝细胞转变为分生孢子，有芽生孢子、关节孢子和厚膜孢子三种。芽生孢子(blastospore)由菌细胞直接出芽而形成，如酵母菌。芽生孢子长到一定大小一般会与母体脱离，若不与母体脱离，便延长呈丝状，形成假菌丝，多数念珠菌属菌种可形成假菌丝。关节孢子

　　(arthroconidium)是由菌丝生长到一定阶段后，出现很多横隔膜，然后从横膈膜处断裂形成矩形、筒形或短柱状的孢子。如毛孢子菌、球孢子菌等。厚膜孢子(chlamydospore)由菌丝内胞浆浓缩，壁增厚，为躲避不利环境而形成的休眠细胞。当条件适宜时又可出芽繁殖。如白色念珠菌、絮状表皮癣菌等可产生。

　　③孢子囊孢子(sporangiospore)：孢子囊孢子由菌丝末端膨大形成囊状结构即孢子囊。其内密集许多细胞核，每个核都被细胞质包围，分隔割裂成块，并逐渐形成孢子壁，最终成为孢子囊孢子。毛霉菌、根霉菌等丝状真菌和酵母样真菌可产生此类孢子。

　　(2)有性孢子：有性孢子分为卵孢子、接合孢子、子囊孢子和担孢子。多见于非致病性

　　(二)真菌的菌落特征

　　多数真菌的培养条件要求不高，在培养基上形成的菌落形态主要有以下两种。

　　1．酵母型菌落形态与一般细菌菌落相似，但较大些，表面光滑、湿润、柔软、边缘整齐、奶酪样。菌细胞以单细胞芽生方式繁殖，不形成真、假菌丝。新生隐球菌的菌落属于此型。有些单细胞性真菌孢子出芽形成芽管，芽管延长不

　　与母细胞脱离，形成假菌丝。假菌丝由菌落向培养基深部生长，这种菌落称为类酵母型(或酵母样)菌落，如念珠菌属的多数菌种。

　　2．丝状型菌落是多细胞真菌的菌落形式，由许多管状、分支的菌丝体和分生孢子组成。菌落呈羊毛状、鹅毛状、棉絮状、绒毛状和粉末状，正、反面呈不同的颜色。曲霉、青霉、毛霉和皮肤癣菌等的菌落属于此型。丝状型菌落的形态、结构和颜色常作为鉴别真菌的依据。

　　二相性真菌在35~37℃条件下培养，在体内或在含动物蛋白的培养基上可形成酵母型菌落；在22～28℃条件下培养，在普通培养基上可形成丝状型菌落，如马尔尼菲青霉菌、粗球孢子菌、副球孢子菌和申克孢子丝菌等。

【真菌培养及鉴定方法有哪些】上海花千坊相关的文章：

真菌检测鉴定方法有哪些10-26

宝宝能力培养方法有哪些04-19

培养孩子好习惯的方法有哪些03-08

培养孩子诚实守信的品德的方法有哪些10-19

父母培养宝宝感知力的方法有哪些08-29

培养幼儿宝宝好性格须知的要点与方法有哪些09-06

鉴定玛瑙真假有哪些好的方法02-15

培养宝宝的抓握技巧和认知能力的方法有哪些10-11

培养幼儿语言表达能力的方法有哪些10-18